一.细胞介绍

HT-22永生化细胞系是由HT-4亚克隆而来，对谷氨酸高度敏感，因此常用来做为谷氨酸诱导的神经毒性的研究模型。

二.细胞特性

（1）来源：小鼠，脑

（2）形态：神经元细胞 贴壁生长

（3）含量：>1x10⁶cells

（4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

（5）用途：仅供科研使用。

三.培养基及培养冻存条件准备

（1）准备DMEM   培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

（2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

（3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

四.运输和保存

（1）冻存细胞：1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

（2）复苏好的活细胞：T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

文献列表：

Peng Z M, Zhang Y Y, Wei D, et al. MALT1 promotes necroptosis in stroke rat brain via targeting the A20/RIPK3 pathway[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2023: 109502.

https://doi.org/10.1016/j.abb.2023.109502

细胞接收后的处理：

（1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

（2）请在4或5x显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

（3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

（4）注意：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。

细胞处理：

（1）冻存细胞的复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8mL完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

（2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4mL含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8mL按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

（3）细胞冻存：收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面以T25瓶为例：

（1）细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/mL。

（2）1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/mL分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

（3）将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存，同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。