

细胞复苏、传代与冻存操作流程
一、仪器与试剂
仪器 | 试剂 | 耗材 |
离心机 | 胎牛血清(FBS) | 离心管(15ml、50ml) |
生物安全柜 | 无菌1×PBS pH=7.2 | T-25细胞培养瓶 |
电动移液器 | 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA | 一次性无菌移液管(2ml、5ml、10ml) |
CO2培养箱 | 完全培养基(含血清) | 1.8mL冻存管 |
倒置显微镜 | 冻存液:90%FBS+10%DMSO | 程序降温盒 |
液氮罐 | 异丙醇 | 护目镜、厚毛线手套等 |
恒温水浴锅 | ||
超低温冰箱 |
二、操作流程
复苏
1) 将恒温水浴锅中的水预热到37℃;
2) 准备一支15ml离心管,加入5ml含10%FBS的完全培养基,放入37℃水浴锅中预热;
3) 戴上护目镜,厚毛线手套后,从液氮罐中取出要复苏的细胞,尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率;
4) 将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中,混匀后,1000rpm离心5min;
5) 准备一个T-25培养瓶,写上细胞名称、日期,再加入4ml完全培养基;
6) 离心完成后弃去上清,用1ml完全培养基重悬细胞后,转入T-25细胞培养中,混匀后转入CO2培养箱中培养静置。
注意:从液氮中取出细胞冻存管时,若冻存管内有液氮进入,需拧松冻存管,排出内部残留的液氮,之后拧紧冻存管,置于干冰上,然后放入37℃水浴中,避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。
传代(细胞传代建议一传二)
1) 当细胞汇合度达到85%以上时,可进行传代。
2) 在生物安全柜内,打开培养瓶瓶口,收集瓶内的培养基;
3) 向培养瓶内加入3ml无菌的1×PBS 后,水平放置培养瓶,使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积,吸弃PBS;
4) 向瓶内加入消化液1ml,浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育1~2min;
5) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起,若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml含10%FBS的完全培养基中,将悬液吸入15ml离心管;
注:如还有部分细胞未消化下来,可采用分步消化:
① 准备一个无菌的15ml离心管,加入2ml含10%FBS的完全培养基;
② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和(避免吹打);
③ 向之前消化的培养瓶中加入1ml胰酶继续消化2min左右,轻拍培养瓶,95%左右细胞脱落后加入2ml含10%FBS的完全培养基中和,中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
6) 1000rpm离心5min;
7) 准备两个新的T-25培养瓶,各加入4ml完全培养基。
8) 离心完成后,弃上清,用2ml完全培养基重悬离心细胞,将重悬后的细胞转入2个T-25培养瓶,每个培养瓶各1ml;
9) 水平放置培养瓶,震荡混匀后,将培养瓶置于37℃,5%CO2培养箱中静置培养。
冻存(细胞冻存建议每瓶T25冻一支)
1)~6)参照传代步骤
7)离心完成后,弃上清,用1mL冻存液重悬细胞沉淀,然后转入1.8ml冻存管中;
8)将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中,之后转入-80℃冰箱中过夜降温;
9)第二天,取出降温完成的序降温盒中的冻存管,尽快转入液氮罐中保存。